萜類化合物是自然界中數(shù)量最大的化合物，存在于幾乎所有生物體中，并扮演著重要的結(jié)構(gòu)性（如細(xì)胞膜上的膽固醇）和功能性（如光合作用中所需的類胡蘿卜素）的角色。有些萜類化合物與病原菌的致病性相關(guān)（如金黃色葡萄球菌的金黃色色素），還有些被發(fā)現(xiàn)具有藥用價(jià)值（如紫杉醇和青蒿素）。萜類化合物的基礎(chǔ)架構(gòu)由最小單位為五個(gè)碳的異戊烯基焦磷酸與二甲基烯丙基組成，遵循“異戊二烯規(guī)則”以“頭-碰-尾”“頭-碰-頭”“頭-碰-中”或其他方式，組合成從十個(gè)到超過(guò)五千個(gè)碳單元的各類化合物。負(fù)責(zé)合成萜類架構(gòu)的萜類合成酶為此領(lǐng)域最重要的研究熱點(diǎn)。研究不同萜類合成酶的催化機(jī)理，是非常重要的科學(xué)問(wèn)題，也為重要萜類化合物的生物合成及代謝工程改造提供了重要的理論基礎(chǔ)。
中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員郭瑞庭、馬延和以及美國(guó)伊利諾伊大學(xué)教授Eric Oldfield 聯(lián)合攻關(guān)，經(jīng)數(shù)年研究，解析了兩種具有不同結(jié)構(gòu)特征的新型“頭-碰-中”萜類合成酶，并闡明了它們的作用機(jī)理。一種酶屬于“頭-碰-中”全α-折疊反式合成酶的MoeN5，另一種則屬于“頭-碰-中”蝴蝶樣折疊順式合成酶的熏衣草焦磷酸合成酶（Lavandulyl Diphosphate Synthase， LPPS）。
“頭-碰-中”全α-折疊反式合成酶MoeN5負(fù)責(zé)合成重要抗生素莫諾霉素（抗菌活性為萬(wàn)古霉素的 10~1000倍，使用至今少有抗藥性報(bào)導(dǎo)）的碳骨架。與典型“頭-碰-尾”全α-折疊反式合成酶由小底物 IPP 結(jié)合在IPP位點(diǎn)去攻擊大底物 FPP產(chǎn)生產(chǎn)物不同，MoeN5 催化更大底物FPG-sugar以“頭-碰-中”的反應(yīng)方式去攻擊大底物 GPP。這種催化過(guò)程為首次報(bào)道，進(jìn)一步揭開(kāi)了十多年來(lái)萜類合成酶研究領(lǐng)域的謎團(tuán)。MoeN5結(jié)構(gòu)為全α-螺旋折疊的同源二聚體，活性區(qū)具有兩個(gè)底物結(jié)合域。其中，結(jié)合 10 個(gè)碳底物GPP的區(qū)域構(gòu)造與其它萜類合成酶相同，而結(jié)合 15 個(gè)碳底物FPG-sugar的構(gòu)造則完全不同。在此區(qū)域利用三個(gè)較大的疏水性氨基酸擠壓C15，造成碳鏈尾端彎曲進(jìn)而迫使 C7-C8 間的雙鍵去攻擊 C10 底物的雙磷酸基團(tuán)，最終形成特殊的 C25 產(chǎn)物（圖1）。MoeN5在進(jìn)行催化時(shí)，GPP 結(jié)合在大底物FPP結(jié)合位點(diǎn)中，F(xiàn)PG-sugar則結(jié)合在活性區(qū)外，將進(jìn)行催化的長(zhǎng)鏈伸入到FPP結(jié)合位點(diǎn)中，并完成催化反應(yīng)。因此，MoeN5也可在無(wú)IPP結(jié)合位點(diǎn)的情況下，進(jìn)行這種特殊的催化反應(yīng)（圖2）。
在MoeN5研究的初期，研究團(tuán)隊(duì)遇到了MoeN5 蛋白質(zhì)晶體容易培養(yǎng)但分辨率低 （大于 3.5 Å）的問(wèn)題，因此無(wú)法用來(lái)觀察活性區(qū)的細(xì)部結(jié)構(gòu)。為解決這個(gè)難題，郭瑞庭帶領(lǐng)研究組嘗試將MoeN5連接數(shù)種不同的小分子量蛋白質(zhì)來(lái)改變晶格堆疊。最終，通過(guò)使用來(lái)源于嗜熱菌的單體 DNA 結(jié)合蛋白Sso7d 與 MoeN5 的融合蛋白，成功結(jié)晶出高分辨率的晶體（約2.2 Å）。通過(guò)與小分子量的單體蛋白質(zhì)（分子量 <10 kDa）的結(jié)合，在不改變主體蛋白質(zhì)性質(zhì)的前提下，可以成功改變晶格堆疊。該方法有望在存在類似問(wèn)題的其他蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析研究中推廣應(yīng)用（圖3）。
“頭-碰-中”蝴蝶樣折疊順式合成酶—熏衣草焦磷酸合成酶LPPS，是一個(gè)全新的非典型萜類合成酶，以“頭-碰-中”的方式縮合兩個(gè) DMAPP 分子產(chǎn)生分枝型萜類產(chǎn)物。LPPS為蝴蝶樣折疊同源二聚體，其活性區(qū)具有兩個(gè)小口袋，分別可容納一個(gè)C5底物。LPPS和底物類似物的復(fù)合體結(jié)構(gòu)顯示，只有兩個(gè) DMAPP 分子可以穩(wěn)定存在于這兩個(gè)口袋中，進(jìn)而發(fā)生縮合反應(yīng)。反應(yīng)中負(fù)責(zé)攻擊第一個(gè) DMAPP 雙磷酸基團(tuán)的 78 位組氨酸是催化反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵位點(diǎn)（圖4）。
綜上所述，此項(xiàng)研究解析了兩個(gè)具有重要應(yīng)用價(jià)值的不規(guī)則萜類化合物合成酶結(jié)構(gòu)，揭示了它們的催化機(jī)理，對(duì)重要萜類化合物的生物合成及代謝工程改造具有重要指導(dǎo)意義。
以上研究獲得了中科院知識(shí)創(chuàng)新工程項(xiàng)目（KSZD-EW-Z-015-2）和國(guó)家自然科學(xué)基金（31200053，31400678，31300615，31300615，31470240，31500642和31570130）的支持。研究結(jié)果在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》（Angewandte Chemie International Edition）雜志以背靠背（back-to-back）形式同時(shí)發(fā)表。其中LPPS成果獲選為 VIP封面文章（圖5）。天津科技大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)碩士生劉美霞、天津工生所臺(tái)灣青年學(xué)者陳純琪和美國(guó)伊利諾伊大學(xué)博士研究生陳璐為L(zhǎng)PPS文章的共同第一作者。天津工生所科研助理張麗蘭、臺(tái)灣青年學(xué)者陳純琪和臺(tái)灣中研院柯子平為 MoeN5 文章的共同第一作者。
圖1. A. MoeN5 晶體結(jié)構(gòu)，為同源二聚體；B. 底物類似物電子云密度圖；C. 推測(cè)的催化機(jī)理
圖2. 典型“頭-碰-尾”全α-折疊反式合成酶和本文發(fā)表的 MoeN5 之不同的催化機(jī)理
圖3. A. Sso7d 和 DNA 的復(fù)合體結(jié)構(gòu)；B. Sso7d和 MoeN5 融合表達(dá)，在晶體中增加了交互作用，長(zhǎng)出不同晶格的晶體
圖4. LPPS 的晶體結(jié)構(gòu)、底物結(jié)合情況及最終的產(chǎn)物(熏衣草醇碳骨架)
圖5. 入選雜志VIP封面
